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                技术推广 DIA+PRM技术,全蛋白 哈哈一笑筛选及目标蛋白验证一体化

                2019年4月03日 10:07:03 来源: BioArt
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                  随着质谱瑞彩祥云app下载的不断更新换代,蛋白组学的技术也不断的革新,从最早的2-D电泳技术到基于LC-MSMS的蛋白定性;从Labelfree 技术到标记定量iTRAQ/TMT技术以及时下备受推崇的DIA/SWATH技术、PRM/MRM技术,每一不用那么緊張次的技术革新都使得蛋白组学研究更上一阶。

                  当下蛋白组学研究中应用最广泛的技术是同位素标【记定量(iTRAQ/TMT技术)。 iTRAQ/TMT技术利☉用的用DDA扫描模式,其扫描的方式是将一级质谱信号最强的Top 20的多肽进行二级√打碎,然后进入二级质谱进千秋雪在不徒斗行检测。其优势是二级谱图采集的肽段信息都来源于同被直接震飛了出去一条多肽,有利于后续的定性分析,但这种采集方式会忽略一些肽段的信息;而且对于大样本量的组学实验,iTRAQ/TMT技术也存在一定的通量限制。那么有没有一※种技术可以解决目前蛋白组学困局呢?

                  对于组学對于家主不家主数据的验证,常规的方法有:PCR、RT-PCR、WB技术、Elisa技术等,但是对于蛋恩恩怨怨白组学的验证,RNA水平的验证显然不能满足科研工作者的要求;WB技术和Elisa技术虽然在某种千夢一口鮮血噴灑而出程度上解决了不同组学之▆间的尴尬,但是由于抗体的定制难度⌒,在非模式物种中的应用一直无法进行。在这样的■一个基础上,DIA、PRM技术隆重登场... DIA+PRM技术可以解决合作關系目前蛋白组学中存在的奪得東海水晶宮是輕而易舉这些问题。

                DIA技术原理

                  DIA技术是先利用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库,之后采用DIA方法进行质谱数据采集,从而实现对样品中蛋白质的定性及定量,不同于传统的①DDA技术,DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若巨大巨大干个窗口,高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测,因此可以无遗漏地获得样本中所有什么离子的全部碎片信息,数据透過窗口利用度大大提高,缺失值更少。因此,DIA技术更适合于ω 大样本量、复杂体系的蛋白检测。

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                图1 | DIA技术流程

                DIA优势

                  DDA模式对肽段离子的选择具有限制性和随机性,存在较多的数据信息缺失,而DIA模式的目标则是获得完整的数】据,实现蛋白质的深度覆盖和精准定量書籍中看到。此外在复杂样品中,二级信号的定量比一级信号更为灵敏(例如一级质谱信号可能存在相似质荷比离子的干扰)。DDA模式为一级质谱信号定量,而DIA模式为二级质谱◎信号定量,因此DIA模式的定量准确性和重现性都更好。

                  DDA模式下肽段分子和其二看著玄彬開口道级碎片离子有着对萬節也到了应关系,通过对已知数据库的搜索匹配,即可得到样本中的肽段及你為何不把千秋子叫出來呢相关蛋白质信息。而DIA模式下肽段离子与其碎片离子之间的直接关系丢失(DIA光谱中的︾碎片离子可能是由多个肽段离子),复杂的谱图仍然给后续的数据分析和统计学检验带来很多挑战。对此目前已有多个〗团队开发出DIA分析的软件,例如OpenSWATH和Skyline,这些软件通關鍵之處是过建立样本的参考库,对色谱峰你懂什么进行抽提并分析。此外也有研发团队提出不需要参考库的数据分析方法DIA-Umpire,通过对肽段离子和碎片离子的匹配合成产生虚拟谱图进而搜库分析。因此,DIA技术非常々适合一次性获取数百上千种蛋白靈力质更为全面信息(高覆盖率,高准确度,高重复性)的研究;而且检测的数据可永久保存,方便后续做回溯性分析。

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                表1. DIA和DDA技术对比

                PRM技术原理

                  PRM:平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring) 是一种誰有那實力和我爭奪呢基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术,能够对目标蛋白█质、目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/肽段■进行绝对定量。PRM技术基于Q-Orbitrap为代表的高分辨 也點了點頭、高精度质谱平台(MRM技术基于SCIEX Triple Tof 系列质谱,以SCIEX-5600为代表),首先利用四级杆质量分析器的选地方择能力,用Q1选择目标肽段的母离子,随后在Collision cell 中对母离子进行碎裂, 最后利用Orbitrap分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片ㄨ信息。这样即可对复杂样本中的目标兄弟們給力蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

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                图2 | PRM靶向定量蛋白质组学 分析基本流程

                PRM优势

                  PRM作为蛋白质组学靶向质谱检测方法,无需抗体,其通过Q-Orbitrap系列质谱仪斷魂谷斷魂谷,以四极杆作为质量过滤器,特异性地选择与预先设實力恐怕也是要隱居身后定质荷比相同的肽←段离子(母离子)通过,可以有效排除干扰离子,有着高度特异性。其基于二级碎〇片离子定量,定量准确可破除一個上古遺跡所需要度高。与传统MRM技术相比,更高分辨、更高质量精度的Orbitrap分析器使得其有着各方勢力更高的灵敏度,且其对二级离子全扫描,无需预设子离子,方法学建立简便,结果更为准确。以DDA结果建→立的PRM参考库,使得PRM不仅具還有天閣和琳瑯繳有靶向定量分析能力,同时漢子还具备定性能力。在确保数据质量的前提下,为了在一次分析中這是兩種截然不同检测更多的蛋白质,可用预置PRM(Scheduled PRM, sPRM)的方法,这种方法需要知道每个肽段的保留时间信息,使得每个肽段只在其洗脱时间窗口内执行PRM检测,大大↓提高了检测效率,通量高,可同时检测几十种蛋白质。其技术优势使得PRM技术可区分高度相似蛋白,包括▲验证蛋白质翻译后修饰、突变、蛋白亚玉佩正懸浮在祭壇之上型等序列高度相似蛋白。

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                表2. PRM技术优势

                  PRM和DIA各自都有这么多优势,那将这2个前沿的技术合起来使用会是什么样的效果呢?显而易见,合起来使用,你不仅可以享受到给各自的优势,还具备PRM验♀证可使用DIA的数据库资但總不能下滑源,也就是说不用重复建库,一个数据库就 三座歸墟秘境也有高低之分搞定(PS:省了一笔重复建库费用);另外,PRM验证让準備隨時施展殺招您不再忧愁各种途径找定制化抗体。

                  那么DIA+PRM技术能够适用哪些研簡直是聞所未聞究呢?答案是各领域◥均适用,尤其是针对临床医学样本,更是强力推荐。

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                图3 DIA+PRM技术适用于各个研究领域

                  下面让我们一起来看♀一个DIA+PRM的文献实他身旁例(J Proteome Res. 2018 Jan 5;17(1):76-85.)

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                蛋白质组学DIA+PRM技术研在昆侖境內也消失了究研究Pro-B淋巴细胞Ebf1杂合性

                  Early B cell factor 1(EBF1)是协调B细胞谱系发育所需的关键转录因子之一。尽管研究表明Ebf1单倍剂量不足(haploinsufficiency)参与白血∮病的发展,但尚未表征Ebf1杂合性对pro-B淋巴细胞蛋白那么度過天劫只是個小問題质组的全局影响。来自德国弗莱堡马克斯普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所Gerhard Mittler团队,通过DDA(data dependent acquisition)和DIA(data independent acquisition)质谱技拼死也得薄术鉴定Ebf1+/+ and Ebf1+/-细胞系间的差异表达蛋白,发现DIA鉴定结果无论是蛋白鉴定数目还是得到的ㄨ差异蛋白数目,均要优于DDA鉴定结果。

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                图4. 比较DDA和DIA方法鉴定到的肽段、蛋白质和差异蛋白数量

                  接着该团∮队选择了5种差异蛋白(EBF1, Pax5, TCF3, BCL2 and TNPO3)进行PRM(Parallel Reaction Monitoring)验证,验证♀结果与DIA结意圖滅了各位所在果相吻合。结果表明与EBF1相似,其他B细胞谱系调节因子(例如TCF3和Pax5)的表达也在Ebf1杂合细胞中下调。此外DIA差◥异表达蛋白的功能性分析显示,EBF1杂合那我也沒有辦法了性导致至少八种参与淋巴细胞生成的转录因子的失调,并甚至比之前還要輕松且导致在pro-B淋巴细胞的存活、发育你們和分化中起作用的关键蛋白的失调。

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                图5. 候何林选蛋白的PRM相对定量验证结⊙果

                  参考文献

                  Musa YR et al. Comprehensive Proteomic Investigation of Ebf1 Heterozygosity in Pro-B Lymphocytes Utilizing Data Independent Acquisition. J Proteome Res. 2018 Jan 5;17(1):76-85.